免疫荧光非特异性染色的消除方法
一、非特异性染色的主要因素
组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。
二、消除非特异性染色的方法
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：
（一）动物脏器粉末吸收法
常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg，在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
（二）透析法
荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml
荧光抗体。
（四）DEAE纤维素柱层析法
标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下：
DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜。常用梯度洗脱法如下：
（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脱部分3。
将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
（七）纯化抗体法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：1．人IgG聚合物的制备在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/l pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。
2．免疫吸收法将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min，离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/l pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以和然释荧光抗体。
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
一、什么是显微镜荧光检测
（一）激光共聚焦显微镜落射荧光观察与一般荧光显微镜一样，是藉标本
1）本身的荧光反应物质吸收荧光光源发出的激发光能而呈现的荧光现象，或2）利用组织及细胞内某成分可与荧光染料（荧光色素）结合并受到荧光激发后所出现特定颜色的荧光供作观察。作出定性、定位（根据荧光图象的形态学特征和颜色）和定量（根据荧光的亮度）。其中：1）为自发荧光，2）为为发荧光。（二）落射荧光与透射光观察的区别
（三）荧光发射原理物质的原子由原子核及核外电子构成。带负电荷的电子沿着自己固有轨道在正电荷的核电场中运动。电子带有一定的动能和势能，在最内层电子层的电子能量最小，随着轨道半径的增加，电子能量加大。当某些物质经光线的照射，特别是经短波长的光线（光波长短，光能量高；波长长，光能量低）照射后，该物质的电子层中的电子吸收光能，由低能级的电子层跳跃到高能级的电子层，或跳跃到同一电子层的高能带，这个过程叫这能级跃叫。电子的高能状态是不稳定的，经过约10-8 秒后，以辐射光量子的形式释放吸收的能量，而回到原来的能态（基态），这种辐射出的能量即荧光。由于物质由激发态回到原来的基态之前，它的一部分能量作为热能被丢失，所以它释放出的荧光波长比激发光的波长要长，即向光谱的红光侧偏移。荧光强度（即发射的荧光光量子数）和激发光（即吸收的光量子数）的强度有关。在一定范围内，激发光越强，荧光也就越强。
（四）一般荧光显微镜与激光共聚焦显微镜的区别
二、荧光检测的优点和缺点：
（一）优点1、敏感2、专一3、快速 4、容易5、简单 6、应用范围广7、可靠
（二）缺点
1、所需仪器—荧光显微镜或激光共聚焦显微镜要比一般的透射光显微镜贵。
2、可能一些试剂也比较贵。
3、染色后的样品保存不长久。荧光有容易淬灭的特性。
三、标本制作的一般要求
（一）组织细胞样品石蜡切片，冰冻切片，涂片，印片、铺片，培养的粘附细胞，悬浮细胞
1、取材：1）组织标本的取材：组织标本主要取之活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本。前三者均可为新鲜组织，后者一般是机体死亡2 小时以上的组织，组织细胞会有不同程度的自溶，细胞组织的生化成分和抗原成分有变性消失和严重的弥散。因此对于新鲜采集或尸检的标本同样要尽快（立即）作处理或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固定进行脱水浸
腊、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮或-70℃冰箱内备用。取材器械（组织细胞损伤，阳性污染），取材部位（病变区—阳性区，对照区）2）细胞标本的取材（1）贴壁生长的培养细胞（2）悬浮的培养细胞：沉淀涂片，细胞离心涂片器（cytospin），载玻片上涂粘附剂—多聚赖氨酸（0.01~0.5%），甲醛-明胶，铬矾明胶，Vectabond 试剂（3）体液沉淀涂片法（4）穿刺吸取涂片法（5）印片法注意点：为要尽量充分洗去细胞周围介质。
2、固定：1）注意固定剂的种类、固定的时间、温度和pH。 2）选择最佳固定液标准是：（1）最好地保持细胞和组织的形态结构；（2）最大限度地保存抗原的免最活性。一些含重金属的固定液在免最组化和细胞化学技术中是禁用的；（3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光。一般可用甲醛（福尔马林）、多聚甲醛、戊二醛、甲醇、酒精（100%或95%）、丙酮（冷）和Carnoy 氏液固定。其中甲醛固定对所检测的物质的抗原性能保存比较好，但是对细胞组织的形态胞组比较大，特别是对如细胞分裂时的纺锤体微管保存不是很好。戊二醛对细胞形态的保持较好，但它是二醛基化合物，交联结合力比甲醛大，由于交联过强，可出现组织改变和空间遮蔽现象，胞组组织的抗原性。甲醇也能比较明显造成细胞的收缩。
3）常用固定剂：（1）醛类固定剂：双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J 链、κ链和λ链的标记效果良好。
①10%钙-福尔马林液（浓甲醛10ml，饱和碳酸钙90ml）；②10 中性缓冲福尔马林液（浓甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml）；③4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛40g, 0.1mol/L pH7.4 PBS 500ml，两者混合加热至60℃，搅拌并滴加1N NaOH 至清晰为止，冷却后加PBS 至总量 1000ml）；④戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，浓甲醛10ml，蒸馏水加至100ml）；⑤醋酸-甲醛液（浓甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理盐水加至100ml）⑥过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（PLP 液）（2）非醛类固定剂适用于多肽类激素的组织固定，单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。①碳化二亚胺②碳化二亚胺-戊二醛液
（3）丙酮及醇类固定剂作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免最活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，解决的办法是和其解试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。①Clarke 氏改良剂（100%酒精95ml，冰醋酸5ml），用于冰冻切片的后固定；②乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液；组织穿透性极强，即使涂片上富于过多的粘液，固定效果仍然良好。③AAF 液（95%~100%酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml）④Carnoy 氏液（100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存备用）；⑤Methacarm 氏液（甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存备用）；⑥丙酮：组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4℃保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片只需冷丙酮内5~10 分钟，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱中备用。是荧光免最细胞化学中很常用的固定液。
4）固定组织时应该注意：（1）力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理；（2）组织块不宜过大过厚，必须小于2.5cm X 1.5cm X 0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm 内；（3）固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20 倍以上；（4）组织细胞固定后应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。
5）固定方法（1）浸需法（2）灌注法（3）前固定和后固定①前固定：切片前固定，染色前固定②后固定：切片后固定，染色后固定3、切片用于激光共聚焦显微镜观察的切片厚度，由于激光穿透力强，所以切片厚度可放宽至40~50um 内，切片不要太薄，以免结构的丢失。1）冰冻切片为免最组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够比较点好地保存多种抗原的免最活性，尤其是细胞表面抗原更应该采用冰冻切片。新鲜的组织及已经固定的组织均可作冰冻切片。冰冻切片后如果不染色，必须吹干，贮存于低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存于冰箱中保存。要注意刀片等接触阳性物质的污染问题。2）石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能连续切片（薄片），组织结构清晰，抗原定位准确。用于免最组织化学技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同，主要是要在比较低的温度下进行。①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽量减少组织抗原的损失；②组织块大小应限于2cm x 1.5cm x 0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸腊；③浸腊、包埋过程中，石蜡应该保持在60℃以下，以熔点低的软腊最好（低温石蜡包埋）；④石蜡切片应放在37℃恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，可
存放于4℃冰箱内备用；5 ⑤冷冻干燥包埋法：可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白质变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。3）振动切片可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成20~100um 的厚片，以漂浮法进行染色。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免最组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能比较好地保留组织细胞内脂溶性物质和细胞膜抗原。
4、封裱（固）剂常用甘油和0.5mol/L pH9.0~9.5 的碳酸盐缓冲液的等量混合液。由于激光共聚焦显微镜观察采集图象很快，所以一般用PBS 或生理盐水也可以。如需将染色后的样品保存一段时间，可以用指甲油在盖玻片周围封闭。暗处保存。一般无须脱水透明以及用树胶封片。如果必须脱水透明，封片最好用DPX。
5、镜油最好使用特制的无自发荧光镜油，如是水镜，用蒸馏水。
（二）玻片及有关观察器皿的处理新载玻片于清洁液中过夜，第2 天流水冲洗，用蒸馏水多次漂洗，然后浸泡于95%酒精中2 小时，烘干备用。盖玻片较薄，所以在清洁液内只需2~3 个小时即可。也可不用清洁液（因为清洁液内有重铬酸盐），用盐酸酒精过夜（70~95%酒精+1N 盐酸），第2 天冲洗如上。载玻片上涂粘附剂：见前述。
四、组织和细胞的自发性荧光检测1、动物组织一般呈现弱淡兰色荧光，其中弹性纤维的荧光较强；
2、红细胞血红蛋白中的卟啉呈红色荧光，但在正常情况下，卟啉和铁离子相结合，铁离子有抑制荧光作用，所以红细胞不发荧光。如在血液中加酸使铁离子游离，或缺铁性贫血，红细胞可呈红色荧光；
3、细胞内的脂褐素呈棕黄色的自发荧光，例如心肌细胞核两侧的肌浆内，随着年龄的增长或在某些疾病的情况下，可见较大量的棕黄色脂褐素荧光颗粒；
4、某些肿瘤细胞在紫外或蓝光激发可呈现明显的自发荧光，可作原位肿瘤的早期诊断；
5、维生素A 呈绿色的自发性荧光。如大鼠食需维生素A 后，在肝细胞、Kuffer 细胞、肾上腺束状带细胞、肺和肾的间质细胞、卵巢间质细胞和黄体细胞等的胞质内均可见到维生素A 的绿色荧光；
6、某些药物也可呈现一定颜色荧光，如奎宁为绿色荧光，四环素为黄色荧光。四环素能与骨基质中的钙结合，利用这一特性，可以用四环素饲养动物以观察新骨质的形成。另外，四环素和癌细胞有较大的亲合力，能在恶性肿瘤内形成黄色的荧光灶；
7、有机体的单胺神经原、消化道和呼吸道粘膜内神经内分泌细胞中的内源性生物胺—儿茶酚胺、5-羟色胺和组织胺等与某些醛类物质在一定条件下可发生缩合反应而呈现荧光。醛和儿茶酚胺（多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素）缩合可产生亮黄绿色荧光，和5-羟色胺及组织胺缩合后呈现黄色荧光。该
方法可显示脑干中单胺神经元胞体内、神经纤维中、消化道呼吸道粘膜的内分泌细胞中的去甲肾上腺素和5-羟色胺，以及交感神经末梢内含量低至5X10-10g 的去甲肾上腺素。
五、荧光组织细胞染色（荧光探针检测，荧光标记检测）
（一）常用荧光素见表
（二）染色方法：浸染（组织或细胞固定在玻片上浸需染色缸，悬浮细胞在悬液中染色，再涂于玻片上）适用于染液较多，样品在玻片上固定比较牢固，染色时间需要比较长。染色均匀。滴染（染色液直接滴

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