一、免疫组化技术 免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC） 技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
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（一）、免疫组化常用染色 方法和步骤（石蜡切片）
SP法 （链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法） :
SP法 （链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法） 原理 采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤 :
主要步骤 1、石蜡切片脱蜡 （与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃烤箱烤片15小时以上→从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中 5~10 min→二甲苯Ⅱ 5~10min →无水乙醇5min →95%乙醇5min →80%乙醇5min →70%乙醇5min →自来水洗
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2、3%H2O2阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS洗3次，每次5min。 3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。 4、滴加5~10%正常山羊血清封闭，37℃, 10min (消除背景非特异性着色)
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5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min再 4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min 。 6、擦干组织周围PBS，滴加生物素标记的第二抗体，37℃, 孵育20min， PBS洗3次，每次5min。
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7、擦干组织周围PBS，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37℃, 孵育20min。 8、PBS洗3次，每次5min，D.W洗2次，DAB显色(DAB必须现用现配)，镜下控制显色程度， 自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤 :
染色步骤 石蜡切片脱蜡到水； 3%H2O2阻断10min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。抗原修复；PBS洗3次，每次5min；
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滴加第一抗体，37℃孵育60min或37℃孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次3min 。擦干组织周围PBS，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，37℃, 孵育20min。 PBS洗3次，每次3min，D.W洗2次，DAB显色，镜下控制，自来水充分冲洗，复染，烤干，中性树胶封片。
（四）抗原修复 :
（四）抗原修复 目的 ： 1、 甲醛固定过程中形成醛键而封闭部分抗原决定簇； 2、甲醛在保存过程中会形成羧甲基而封闭部分抗原决簇；
3、固定剂固定组织时，会使组织中蛋白与蛋白之间发生交联，也可能封闭抗原决定簇。 4、抗原决定簇被封闭之后,会影响抗原抗体的结合,因此在染色时需先进行抗原修复，通过抗原修复，充分暴露抗原决定簇。使抗原抗体得以充分结合。
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抗原修复的作用机理是 1、抗原修复液中的化学物质分子或离子与部分抗原决定族结合产生化学反应，增加了细胞和组织的通透性，便于抗原抗体的充分结合。 2、高温可以使某些已封闭的抗原决定族得以重新暴露和修复。 3、微波是一种高频电磁波，可打开蛋白质之间的交联键，从而使抗原修复。
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抗原修复注意事项 :
抗原修复注意事项 1、应根据不同的抗原选择合适的修复方法。 2、热处理后应注意自然冷却，酶消化后要洗干净。 3、防止切片干燥，特别是热修复时要防止修复液蒸发而使切片干燥。
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4、注意形态学结构的改变和脱片问题：酶消化浓度过高，时间过长、温度过高都可能导致组织的形态结构改变；热修复时间过长也可能导致形态学结构改变和脱片。
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（五）常用溶液的配制 1、0.01MPBS: 磷酸二氢钠(NaH2PO4) 1.5g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 14.5g 氯化钠 42.5g 氢氧化钠 2粒 加蒸馏水 5000ml
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2 、 3%H2O2 甲 醇 450ml 30%H2O2 50ml 混匀。
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3、pH值6．0的柠檬酸缓冲液 3.1 储存液： A液：枸橼酸 21.01g 蒸馏水 1000ml B液：枸橼酸钠 29.41g 蒸馏水 1000ml
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0.1 3.2 工作液： A液 9ml B液 41ml 蒸馏水 450ml 溶液pH值 为6.0
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4、胰蛋白酶(0.05%~0.1% ) 取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.1% pH7.8的无水氯化钙水溶液中溶解即可。
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5、胃蛋白酶（0.4%） 胃蛋白酶 0.4克 0.1mol/L HCl 100ml * 配制好的酶用5ml小瓶分装，保存于冷冻箱，用前拿出来溶解。
（六）结果观察(一) 胞浆阳性 :
（六）结果观察(一) 胞浆阳性
(二) 胞核阳性 :
(二) 胞核阳性
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二、常见问题及对策
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由于免疫组化染色过程有许多步骤和环节，每一个步骤和环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件很容易的事，需要病理技术员和医生密切配合，共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。根据我们多年的经验，发现目前，免疫组化制片过程中常见的问题主要有如下几点：
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常见问题 1、组织的前期处理 2、脱片问题 3、阴性片 4、背景染色
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（一） 组织的前期处理要规范固定：新鲜标本一定要及时固定，离体后30min内固定,大标本需切开固定（以防止组织内自溶，抗原被破坏），固定时间不要超过24小时，以免抗原被封闭，影响结果的表达；固定剂：10%中性甲醛，4%多聚甲醛取材：一般为2×2×0.2cm 脱水、透明要充分
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（二）脱片问题：这是由于玻片处理不当、切片太厚或组织特殊引起。玻片的处理：我们应该将玻片清洗干净。新购买的载玻片用洗衣粉浸泡10小时左右——自来水冲洗干净——蒸馏水冲洗2遍，烤干——浸泡防脱片剂多聚赖氨酸 ——烤干备用。
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多聚赖氨酸的浸泡从公司购买的多聚赖氨酸一般用双蒸水按1:10稀释；每张玻片必须浸泡多聚赖氨酸5min以上,烤干备用；注意已浸泡多聚赖氨酸的玻片应保持干燥，防止长霉
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切片不能太厚，以2-3um为宜，漂片要平整，不能有皱褶、气泡，烤片需60℃，15h以上。对于骨组织和纤维成分较多的组织如乳腺、皮肤特别容易脱片，应特别注意切薄片，最好不超过2um厚，必要时可切片后先做微波1－2min，再烤片，以使组织粘贴牢固。
（三）阴性片染色结果中看不到任何阳性信号，出现这种现象有两种可能：真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。
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假阴性结果：假阴性结果的原因可有： 1、选错蜡块，切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞，因此我们选择蜡块时要注意不要选错。 2、组织未进行抗原修复或修复方法不当，抗原得不到表达，因为有的抗原需热修复，有的需酶消化， 才能表达。 3、一抗失效，二抗、三抗使用不当。
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3、一抗失效，二抗、三抗使用不当。 在购买抗体时，我们要特别注意抗体的匹配问题。我们知道一抗有的来源于鼠,有的来源于兔,因此我们在购买二抗时要注意:对于来源于鼠的一抗,必须购买抗鼠的二抗;对于来源于兔的一抗,必须购买抗兔的二抗才能相匹配，现在许多试剂公司有鼠兔通用的二抗购买，解决了这个问题。
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解决假阴性染色的办法首先 选择正确的蜡块和抗原修复方法，注意抗体的有效期和抗体匹配问题；同时设立“阳性对照”。阳性对照片可以从公司购买，亦可自己准备。如果阳性对照有表达，说明染色过程和试剂无问题。反之，表明染色过程中某个环节或试剂出了问题，应一一寻找原因。
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阳性库的建立对于阳性对照，顺便提一句，作为病理科医生和技术员，我们应善于从平常的工作中收集阳性蜡块，建立自己的阳性对照库，便于随时取来作阳性对照。 具体办法：工作中发现表达很好的组织立即将其蜡块收集起来，集中放入中空干燥器中 ，登记日期、蜡块号码，染色方法，抗原修复方法，阳性抗体名称、购买公司。并存入电脑。
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（四）背景染色 免疫组化除正常的真实阳性信号外，常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色主要有以下几种：
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1、 切片全着色切片全着色是指整个切片都染上颜色(图1)，着色的强度可深可浅，分不清哪些组织是阳性，哪些组织是阴性，出现这种现象的原因有：
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1.1、抗体浓度过高，主要是一抗浓度过高，应该在每次使用新的浓缩型抗体之前先做预实验，确定一个最佳浓度。 1.2、一抗变质、抗体孵育时间过长、或者温度过高，因此操作时应注意抗体的有效期，同时严格按照操作规程进行，
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1.3、组织变干：抗原修复时修复液溢出后未及时补充液体使组织变干、染色切片太多、动作太慢、 抗体流失等都可造成组织变干 。操作要认真仔细，采用PAP笔画圈，可以有效避免抗体流失，也能提高操作速度。 1.4、DAB 变质或显色时间太长：DAB最好现用现配， 显色在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应 。
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2 、切片边缘着色 切片边缘着色也是一种非常常见的现象，这种现象称为边缘效应 （图2）。产生的原因：
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2.1、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：滴加试剂 应超出组织边缘2 mm。为了避免油剂表面张力的影响，PAP笔画圈时应超过组织边缘3-4 mm。
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2.2、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽 。解决办法：制备优质的多聚赖氨酸玻片，切出尽量薄的组织切片，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死组织块。
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3、切片着色不均匀 是指组织 呈灶片状着色（图3）。 产生这种现象得原因有： 3.1、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，导致显色过深 。还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色，周围组织深染。 滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。
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