六型重组腺相关病毒（rAAV6）高效并优先感染星形胶质细胞的体内外研究
摘要：
 
       腺相关病毒载体是越来越受欢迎的载体工具，它可将基因输送到中枢神经系统，具有非致病性、免疫原性低、可感染分裂细胞和非分裂细胞的特点。它的一个局限性是对神经类细胞的感染有取向性，神经胶质细胞特别是星形胶质细胞的感染效率很低。为了克服这个局限，先前的研究中利用星形胶质细胞的特异性的启动子来构建载体包装病毒，以及用不同血清型的病毒来感染星形胶质细胞，但是各种研究中的感染效率并不一致。在本实验中，我们测试了7种商业化的腺相关病毒的血清型，血清型1、2、5、6、7、8、9（腺相关病毒由维真生物提供），通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达来测试各种血清型病毒感染星形胶质细胞的能力。在细胞培养中，rAAV6表现出稳定的高效的感染效率，而rAAV2只有一些批次的病毒对星形胶质细胞有感染性。为了证明我们所用的病毒活性没有问题，我们将所用病毒感染公认的易感染细胞ARPE-19细胞并都表现出很高的感染性。基于体外实验结果，我们选用rAAV6和rAAV2进行了体内实验，同样条件下感染星形胶质细胞和神经元细胞，感染3个星期
后，对病毒表达蛋白GFP、神经元细胞特异性标志蛋白NeuN以及星形胶质细胞特异性标志蛋白GFAP进行免疫染色，我们发现rAAV6对星形胶质细胞有很高的感染率（90%以上细胞被感染），但是对神经元细胞的感染率很低（约10%感染率），相反地，rAAV2对神经元细胞有高感染率（约65%），但是不易感染星形胶质细胞（约20%）。总之，我们的研究表明rAAV6能够被用作对体内星形胶质细胞进行基因表达调控（过表达或敲低）的工具。
 
前言
 
      病毒载体在中枢神经系统中广泛用于基因递送和目的基因的表达。其中，腺相关病毒（AAV）已越来越受欢迎，它具有以下优势：非致病性，低免疫性，能有效转导分裂细胞和非分裂细胞，并能产生持久的基因表达。 AAV载体在基础研究中的成功使其应用于临床实践中，包括在中枢神经系统中的应用。在过去的十年来，重组AAV已经应用于脑组织，
脊髓和视网膜的临床试验中。rAAV在基因治疗中的安全性也越来越有吸引力，那些在中枢神经系统中的实验，以及几种人类单基因疾病的表型校正实验说明了rAAV应用的安全性，这也进一步提高了rAAVs在基础研究中的利用价值。
      腺相关病毒(AAV)是一种无包膜的单链 DNA 病毒，是细小病毒家族的一员，通常需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的帮助，才能进行自我复制。简单的AAV基因组有两个反向末端重复区（ITR），其中间有约4.7kb的线性单链DNA的开放阅读框。 rep部分基因组负责编码病毒复制和基因组特异性位点整合的四种蛋白质；另外的cap开放阅读框负责生成三种不同的衣壳蛋白。在应用于基础研究和临床实践中的重组AAVs，rep和cap基因被删除，取而代之的是目的基因序列或shRNA序列，抗生素筛选标记等基因序列。因此，重组包装AAV需要额外的编码rep基因的质粒（通常衍生自AAV2）和编码cap基因的质粒，以及提供腺病毒辅助基因的辅助质粒，cap基因可来自于各种血清型或进行过基因改造的衣壳蛋白基因）。
      AAV衣壳蛋白的不同决定了它们在依据细胞类型和组织嗜性方面的血清型之间的差异。 原型AAV2与硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合从而接近靶细胞，并与靶细胞的共同受体相互作用，
例如整合素αVβ5，αVβ1，肝细胞生长因子和层粘连蛋白。有助于其他血清型AAV感染的细胞表面受体的研究的较少，普遍认可的有唾液酸或半乳糖的蛋白多糖。最近的一篇文章发现了孤儿跨膜蛋白KIAA0319L可作为几种常见的AAV血清型的受体，包括AAV6，这将有助于我们进一步理解细胞机制（Pillay et al.,2016）。
      星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多、功能最复杂的细胞，它对正常大脑功能和许多神经障碍方面有非常重要的作用。随着人们对正常和病理细胞研究兴趣的增长，对能够有效靶向星形胶质细胞的病毒载体的需求不断增长。但是，过去大多数的研究都集中在rAAV对神经元细胞的感染上。最常用的血清型rAAV2，几乎对所有啮齿动物和非人类灵长类动物中的神经元细胞都有应用研究。rAAV1,5,8和9也有相同模式的报道（Burger et al., 2004;Cearley and Wolfe, 
      2006; Dodiya et al., 2010; Markakis et al.,2010）。相比之下，其他文章还报道了rAAV1,5,8和9对星形胶质细胞有一定的偏好性（Davidson et al., 2000; Foust et al., 2009; Gray et al., 2011;Aschauer et al., 2013; Petrosyan et al., 2014; Watakabe et al.,2015），甚至有报道rAAV8和rAAV-rh43对转导星形胶质细胞有优势（Lawlor et al., 2009; Aschauer
et al., 2013）。不同的血清型的AAV对胶质细胞的取向性不同的原因仍少有报道（更多细节见“讨论”）。一些研究对星形胶质细胞的特异性启动子进行了改进，如gfa2或gfaABC1D（Merienne et al., 2013; Weinberg et al., 2013）。然而，即使有这些改进，对星形胶质细胞的感染效率并未有很大的提升，新的靶向星形胶质细胞的AAV载体将在该领域非常受欢迎。这篇文章中我们研究了之前较少研究的rAAV血清型之一，rAAV6，其能有效靶向大鼠大脑皮层的星形胶质细胞。
 
材料和方法
 
材料与试剂
牛血清白蛋白（BSA)、DAPI、N-propyl-gallate、Triton X-100，所有的盐和溶剂均购自Sigma–Aldrich (St.Louis, MO, USA)，均使用最高纯度的，除非另有说明。细胞培养基、血清、抗生素使用 Gibco R品牌，重组蛋白酶TrypLE R购自Life Technologies/Thermo Fis
her Scientific(Waltham, MA, USA)。所使用的抗体的来源和目录编码在文章中标注。
 
rAAV载体
      血清型rAAV1，rAAV2，rAAV5，rAAV6，rAAV7，rAAV8和rAAV9 的腺相关病毒从维真生物（Vigene）公司获得。这些病毒是用三质粒共转染293细胞包装制备的。主要的质粒pAV-U6-GFP含有AAV2 ITRs序列，U6启动子后面有shRNA插入位点，CMV启动子启动EGFP基因表达，氨苄青霉素抗性。Rep 和 Cap质粒以及辅助质粒提供了病毒复制机器的组件和决定AAV血清型的衣壳蛋白。HEK293细胞裂解后，病毒颗粒通过碘克沙醇梯度超速离心进行纯化。有关这些病毒的详细信息及他们的包装和纯化过程可以在维真生物（Vigene）公司网站查到。作为对照，根据先前公开的方法（Gao andSena-Esteves, 2012），我们也使用了马萨诸塞大学医学院（Worcester，MA，USA）包装的rAAV1，rAAV2，rAAV5和rAAV9的腺相关病毒。这种腺相关病毒也由三重质粒转染HEK293细胞包装制备的。这些病毒载体由CAG启动子编码翻译EGFP蛋白，病毒血清型由衣壳蛋白种类决定。同样的病毒纯化通过CsCl梯度超速离心方法。在以上两类rAAV病毒滴度通过定量聚
合酶链反应（qPCR）测定，纯度通过蛋白凝胶电泳后考马斯亮蓝染色或银染测定。

原代大鼠星形胶质细胞和视网膜色素上皮细胞的细胞培养
      原代星形胶质细胞是从1-2天龄的Sprague-Dawley大鼠幼仔的大脑中提取制备的。所有动物程序严格遵守由国际动物中心和奥尔巴尼医学院使用委员会制定的NIH实验动物护理和使用指南。简单来说，大鼠幼仔被快速杀死解刨，迅速取到大脑组织。将皮质与脑膜和海马体分离，并置于预冷的Opti-MEM中。将脑组织切碎并在等量的含有重组蛋白酶的TrypLE和Opti-MEM混合液中进行酶解，并另外补充DNase I（1mg / ml）。在37℃下重复用TrypLE进行细胞提取3次。第一次提取的细胞不要，将最后两次提取的细胞合并并通过1000×g的短暂离心沉降。细胞重悬于DMEM中，其含有10%热灭活马血清（HIHS）、50 U/mL青霉素和50μg/ mL链霉素，然后按每瓶200,000个细胞的密度接种在聚-D-赖氨酸材质的T-75的培养瓶中。将培养的细胞放置在含5%CO2的37度培养箱中培养2-4周。每周更换两次培养基。对星形胶质细胞的标记物胶质纤维酸性蛋白的抗体染色（GFAP，Sigma货号# g3893），定期检测培养物纯度，纯度需大于 95％。
人类视网膜色素上皮细胞用作AAV功能的另外的对照。已知这种细胞容易被多种血清型的AAV感染（Surace and Auricchio, 2008）。 ARPE-19在含有10％胎牛血清和抗生素的的DMEM中培养，同样选用T75培养瓶。在用TrypLE提取细胞后定期传代。
 
体外rAAV感染和免疫反应过程
      将原代星形胶质细胞或ARPE-19细胞接种在24孔板中，用七种不同的rAAV病毒分别进行感染。基于试验过的滴度摸索实验，我们选用105gc/cel的病毒量进行实验，这样感染效率最好。首先，将各种rAAV分别感染的细胞在Opti-MEM 培养基中37℃下进行孵育，孵育4h后，每个孔补充等体积的DMEM，星形胶质细胞用含10％HIHS的DMEM，ARPE-19细胞用含10%FBS的DMEM。培养20小时，根据需要用新鲜的DMEM-HIHS或DMEM-FBS替换含rAAV的培养基。48-72小时后测定病毒感染率（GFP表达）。测定感染效率的方法：将培养基中的细胞用PBS缓冲液洗涤两次，然后用含4％多聚甲醛的PBS缓冲液在室温（20℃）下进行固定，再用PBS洗涤两次，然后用含0.1％Triton X-100的PBS在室温下透析15分钟。再经过两次PBS洗涤，然后再用含1％BSA的PBS在室温下封闭1小时。免疫反
应过程：在室温下，将固定好的星形胶质细胞用兔多克隆抗GFP抗体（Life Technologies / Thermo Fisher Scientific，目录＃A6455,1：2,000）或者鸡多克隆抗GFP抗体（Life Technologies / Thermo Fisher Scientific，目录号A10262，1：500稀释）孵育1小时。用PBS洗涤三次，每次5min，以除去未结合的一抗，然后将细胞与偶联Alexa-Fluor 488的山羊抗兔二抗（Life Technologies / Thermo Fisher Scientific，A11008,1：1,000稀释）或偶联Alexa-Fluor 488的山羊抗鸡二抗（Life Technologies / Thermo Fisher Scientific，目录＃A11039,1:500稀释）进行孵育，在室温下封闭1小时。用PBS洗涤三次，每次5min，以去除未结合的二抗。用DAPI（10μg/ ml）复染细胞，在室温下孵育15分钟，并用PBS洗涤一次。用Zeiss LSM510META共聚焦显微镜（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）捕获Alexa-488荧光图像。为确保GFP表达比较的有效性，所有图像在相同的条件下进行拍摄。
rAAV注射动物
      根据国际动物保护法，以及奥尔巴尼医学委员会制定的关于保护和使用实验室动物的NIH规定，在对动物麻醉处理的情况下注射rAAV病毒。约200g重的5周龄雄鼠在含30%氧气和70%氮气的环境中用异氟醚进行麻醉（5%浓度用于诱导，2%浓度用于维持），用直
肠探头进行体温检测，用加热垫维持老鼠体温在36.5-37度。将动物置于啮齿动物立体定位框架上（David KopfInstruments，Tujunga，CA，USA）。在头皮皮下局部额外的注射布比卡因（Hospira，Lake Forest，IL，USA）进行头皮麻醉，在头皮上做一个切口暴露颅骨，接下来，在头骨上用力矩II钻（Harvard Apparatus，Holliston，MA，USA）钻一个小孔，这个位置在桶状皮层区域的正上方(正中线前方2 mm , 前卤边缘5 mm)。用含有rAAV2或rAAV6病毒的注射器注射老鼠的硬脊膜下2.1毫米处，注射速度是0.2ul/min,注射病毒量为1ul。等待10min以确保病毒进行适当的扩散，然后将注射器向上拔出1mm，再注射1ul的病毒。缝合切口，按0.1mg/kg的量皮下注射布鲁林诺啡，并在伤口处涂抹三联抗生素软膏以愈合伤口，术后两天每日两次喂食丁丙诺啡。术后喂养3个星期以确保病毒的扩散和标记蛋白GFP的表达。
 
病毒感染后的免疫反应分析
      为了评估病毒的感染效率，我们对GFP的表达进行免疫组化分析。首先给老鼠注射致死量的戊巴比妥钠，然后用含肝素溶液的PBS缓冲液灌注心脏内，再用含4%多聚甲醛的P
BS缓冲液灌注。将大脑取出，在4度下用4%多聚甲醛固定24小时，然后转移到30%的蔗糖溶液中（4度）进行低温保护。取出蔗糖溶液中的脑组织放入Tissue-Tek O.C.T.冰冻切片包埋剂中固定在低温装置中冷冻至-20度，然后用Leica CM3050恒冷箱切片机切片，片厚25um，切片防御冷藏液中储存在-20度冰箱中，冷藏液的成分为50%的Tris缓冲生理盐水（TBS）、30%乙二醇、20%甘油。染色前，将切片用TBS缓冲液清洗5次，然后在室温下用含3%正常山羊血清（载体实验室，Burlingame、CA、美国）和0.3%Triton X-100的溶液封闭30分钟。首先，用兔多克隆抗GFP抗体在4度条件下孵育24-48h，抗体用3%正常山羊血清稀释。然后，用TBS缓冲液清洗5次切片，再用山羊抗兔标记Alexa–Fluor 488的二抗在常温下孵育2h，抗体同样用3%正常山羊血清进行稀释。为了进一步验证是哪种细胞类型感染了AAV病毒，我们将相同的切片用小鼠单克隆抗NeuN抗体（(EMD-Millipore, cat. # MAB377, 1:500) 或者小鼠单克隆抗GFAP抗体进行孵育，染色程序同上，所不同的是所用的山羊抗小鼠的二抗用Alexa–Fluor 555标记（(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, cat. #A21422, 1:400)。二抗孵育后，用TBS清洗5次以除去未结合的二抗。然后将脑切片用0.1ug/ml的DAPI在室温下复染15分钟，再用TBS清洗一次，最后涂抹防褪色剂N-propyl-gallate并用透明指甲油密封，置于显微镜下。为了保证结果的准确性，我们改变
了初级抗体的使用顺序并发现当最后用GFP抗体时，得到的GFP信号更强，而且在初级抗体中加入0.3%的 Triton X-100能使得抗体更好的渗透到切片中。需要强调的一点是细胞取向的定量分析都是按照上面介绍的方法进行实验的，而且抗体的使用顺序并不会影响病毒感染效率和细胞取向的分析结果。所有的切片的荧光图片都是用Zeiss LSM-510 Meta共焦显微镜用250×放大而且是相同的曝光和设置条件下拍摄的。半脑图像是用Leica TCS SPE共焦显微镜在15×放大条件下拍摄便于更形象的观察病毒的感染情况。一系列的六张图片的展示是用一个具有代表性的图像拼接软件拼接而成。

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