#论著#
氨氯地平对大鼠心室肌细胞内钙离子浓度的影响
来利红 王如兴 蒋彬 刘志华 杨向军 宋建平 李红霞 蒋文平
=摘要> 目的 探讨不同旋体氨氯地平对大鼠心室肌细胞内钙离子浓度的影响。方法 采用荧光探针Fura -2乙酰羧甲酯(Fura -2/A M )测定细胞内钙离子浓度，并比较1、5、10、50和100L mo l/L 左旋、右旋和混旋氨氯地平对细胞内钙离子浓度的影响。结果 不同浓度左旋和混旋氨氯地平(1、5、10、50和100L mol/L )降低细胞内钙离子浓度分别为(111?011)%、(1513?318)%、(5811?512)%、(7315?517)%和(8819?712)%及(016?011)%、(511?210)%、(1512?317)%、(6518?411)%和(7211?512)%；半效抑制浓度(IC 50)分别为8113)L mo l/L 及16119L mol/L ；不同浓度右旋氨氯地平对细胞内钙离子浓度无影响。结论 左旋和混旋氨氯地平降低细胞内钙，且呈浓度依赖；而右旋氨氯地平对细胞内钙无影响。
=关键词>  氨氯地平；细胞内钙离子;Fura -2乙酰羧甲酯
=中图分类号> R542  =文献标识码> A  =文章编号> 0253-3685(2007)09-0924-03Eff ect of different isomers of amlodipine on cytosolic C a 2+of rat ventricular myocytes  L AI L iho ng ,WANG R uxing ,JI ANG Bin ,et al.D epar tment o f Car dio lo gy ,Aff iliated First Ho spita l ,Soo cho w University ,Suzhou 215006,CHI NA
=Abstract > Objective  T o investig ate the effects o f differ ent isomers of amlodipine(A ml)o n cy toso lic Ca 2+of SD rat ventricular my ocytes.Methods  Concentr ations of cytoso lic Ca 2+w ere measured by fluo rescent pr obe Fur a -2/AM.Effects on cyto solic Ca 2+w ith S -A ml,R -A ml and R,S -Aml in 1,5,10,50and 100L mol/L wer e compared.Results  When 1,5,10,50and 100L mol/L of amlodipine wer e used t he concentr ations o f cy tosolic Ca 2+w ere reduced by (111?011)%,(1513?318)%,(5811?512)%,(7315?517)%and (8819?712)%,r espectiv ely,w ith a half inhibitio n co ncentrat ion (IC 50)o f 8113L mol/L fo r S -Aml,and by (016?011)%,(511?210)%,(1512?317)%,(6518?411)%and (7211?512)%,respect ively,wit h a IC 50o f 16119L mo l/L for R,S -Aml 1
Ho wever ,R -A ml in different concent ratio ns had no effect o n cy tosolic Ca 2+
.C onclusion  T he cy toso lic Ca 2+w ere reduced by R,S -Aml and S -A ml,but not R -A ml.
=Key words >  A mlo dipine;Cy toso lic Ca 2+
;F ur a -2/A M
[Jiangsu M ed J ,September 2007,33(9):924-926.]
作者单位:215006 苏州大学附属第一医院心血管病研究室
责任作者：蒋文平 E -mail:jiangw enpin
二氢吡啶类钙通道阻滞剂是临床上最常用的心血管药物之一，近年来发现除硝苯地平外，所有二氢吡啶类钙通道阻滞剂都有手性结构，而其对映体生物活性常常不同，甚至相反[1]。氨氯地平是临床上常用的二氢吡啶类钙通道阻滞剂，有左右两种对映体，即左旋氨氯地平和右旋氨氯地平，临床上使用的氨氯地平通常为混旋氨氯地平，即由等量左旋和右旋氨氯地平混合而成。研究表明
[2,3]
只有左旋和混
旋氨氯地平具有扩张血管作用，而右旋氨氯地平无扩张血管作用，笔者采用细胞内钙离子浓度荧光测
定技术，研究不同旋体氨氯地平对Spraque -Daw ley 大鼠心室肌细胞内钙离子浓度的影响，以探讨不同旋体氨氯地平作用机理，为临床准确合理使用不同旋体氨氯地平提供理论依据。
材料与方法
一、实验器材、试剂和溶液组成
超高速激发光波长转换器LAMBDA DG -4，冷却式数字电荷耦合装置相机Co olSNAP ES，专业钙离子图像分析处理软件MetaFluor,IX71倒置显微镜,SA -OLY/2型细胞池。左旋、右旋和混旋氨氯地平由吉林天风制药有限公司惠赠，化学纯度9915%，光学纯度9910%，其中混旋氨氯地平为等质量的左旋氨氯地平和右旋氨氯地平混合而成。
Fura-2/AM由美国Calbiochem公司生产。D-H anks液(单位:g/L):NaCl8100,KCl0140, Na2H PO4#12H2O,0113,KH2PO40106,NaH CO3 0135，酚红0102,NaH CO3调pH值为714。
二、耐钙大鼠心室肌细胞分离
耐钙大鼠心室肌细胞分离方法和所需器材及溶液组成见本实验室既往研究报道[4]。
三、细胞内钙离子浓度测定法
在细胞池中加入1ml D-H anks液，再加入1~ 2滴细胞悬液,3~5min后加入1m mol/L的Fura-2/AM，终浓度为5L mo l/L，在室温下避光孵育30 min。用D-H anks液连续冲洗至少2~3次，在倒置显微镜下，每次选取一个或一个以上心室肌细胞作为靶细胞进行细胞内钙离子浓度测定。激发波长为340和380nm，发射波长为510nm，连续记录单个或多个心室肌细胞给药前后荧光信号强度的变化。将在340和380nm两个激发波长下的荧光强度吸收信号F340和F380储存在计算机中进行处理和分析，测定
时依次记录静息和药物加入后荧光信号强度比值R(F340/F380)。使用公式[Ca2+]i=B* Kd*(R-Rmin)/(Rmax-R)将荧光信号强度的比值换算成细胞内钙离子的浓度[5,6]，式中[Ca2+]i代表细胞内游离钙离子的浓度,B是与选定波长有关的比例系数,Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224nmol/L,R是不同实验条件下测得的荧光信号强度的比值;Rmax为加入011%Tr iton X-100后测得的最大荧光信号强度比值,Rmin为加入10 mmo l/L乙二胺四乙酸(pH>815)后，测得的最小荧光信号强度比值。
四、不同旋体氨氯地平作用后细胞内钙离子浓度测定
在氯化钙浓度为118m mol/L的细胞外液中加入40mm ol/L氯化钾并测定细胞内钙离子浓度，然后分别加入1、5、10、50和100L m ol/L浓度的左旋、右旋和混旋氨氯地平，并分别测定细胞内钙离子浓度。
五、统计学处理
计量资料以均数?标准差(
x?s)表示，以SPSS 1115统计分析软件进行分析。单独两组间比较采用成组t检验，方差不齐采用M ann-Whitney U检验；三组以上的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用q检验，方差不齐采用Kruska-l Wallis H检验，以P<0105为差异有显著意义。运用OriginPro715科技绘图及数据分析软件，计算药物半效抑制浓度(IC50)。
结果
一、大鼠心室肌细胞负载Fura-2/AM
在室温Fura-2/AM终浓度为5L mo l/L的条件下，负载Fura-2/AM30min，可见负载效果较好的耐钙杆状心室肌细胞内荧光信号强度较强，而不耐钙圆形心室肌细胞内及细胞外液中荧光信号强度较弱。
二、加入氯化钾、氯化钙、T riton X-100和EGTA后细胞内Ca2+浓度
在D-H anks液中，测定细胞内钙离子浓度为(12516?1012)nm ol/L；加入40mm ol/L氯化钾后，细胞内钙离子浓度为(12610?1010)nmol/L，氯化钾加入前后细胞内钙离子浓度无明显变化(P>0105,n=12)。在D-H anks液中加入118 m mol/L氯化钙，再加入40mm ol/L氯化钾后，则细胞内钙离子浓度升高至(20312?1212)nmo l/L，与加入氯化钾前相比细胞内钙离子浓度明显升高(P<0105,n=10)。用荧光信号强度比值R观察加入氯化钙、氯化钾、T rito nX-100和EGTA后细胞内钙离子浓度变化，可见加入氯化钾后R值升高，加入011%Tr ito nX-100后,R值升高至最大(Rmax)，加入10mm ol/L EGTA(pH>815),R值降至最小(Rmin)。
三、不同旋体氨氯地平对心室肌细胞内钙离子浓度影响
11不同浓度左旋氨氯地平对细胞内钙离子浓度影响将细胞置于浓度为118mm ol/L氯化钙的D-H anks溶
液中，加入40mmo l/L氯化钾，然后分别加入左旋氨氯地平1、5、10、50和100L mo l/L，则细胞内钙离子浓度分别降低(111?011)%、(1513? 318)%、(5811?512)%、(7315?517)%和(8819? 712)%，采用Bo ltzmann函数方程进行拟合，计算IC50为8113L mol/L。
21不同浓度混旋氨氯地平对细胞内钙离子浓度影响上述相同浓度混旋氨氯地平降低细胞内钙离子浓度分别为(016?011)%、(511?210)%、(1512?317)%、(6518?411)%和(7211?512)%, IC50为16119L mol/L。
31不同浓度右旋氨氯地平对细胞内钙离子浓度的影响上述相同浓度右旋氨氯地平对细胞内钙离子浓度无抑制作用，表现为加入右旋氨氯地平后
细胞内荧光信号强度和荧光信号比值无变化。
讨论
氨氯地平为二氢吡啶类钙通道阻滞剂，有左右两种对映体，即左旋和右旋氨氯地平，临床研究表明左旋和右旋氨氯地平具有不同的生物学特性。左旋和混旋氨氯地平具有扩张血管作用，而右旋氨氯地平无扩张血管作用，但其作用机理尚不清楚，目前国内外尚无不同旋体氨氯地平对心室肌细胞内钙离子浓度影响的报道。
在研究不同旋体氨氯地平对心室肌细胞内钙离子浓度影响前，首先使心室肌细胞在高钾溶液中除极化。其机理是：由于静息电位是钾离子的平衡电位，加入高浓度氯化钾后细胞外钾离子浓度升高，表现为膜电位上升，心肌细胞发生除极化；当心肌细胞除极达到一定程度，可激活细胞膜上L型电压依赖性钙通道，此时如心肌细胞外液中有钙离子存在，钙离子则可通过L型钙通道进入心肌细胞内，使心肌细胞内游离钙离子浓度增加，表现为荧光信号强度增强和荧光信号强度比值增加；此时如细胞外无钙离子存在，即使加入氯化钾，因无钙离子进入心肌细胞内，细胞内钙离子浓度仍无变化。
笔者通过采用细胞内钙离子浓度荧光测定技术，比较不同浓度左旋、右旋和混旋氨氯地平对细胞内钙离子浓度变化的影响。发现左旋和混旋氨氯地平可降低细胞内钙离子浓度，表现为加入左旋和混旋氨氯地平后细胞内荧光信号强度减弱，荧光信号比值下降，其机理可能是由于左旋和混旋氨氯地平可阻断由氯化钾引起的电压依赖性L型钙通道的开放，从而阻止细胞外钙离子内流，且在一定范围内，左旋和混旋氨氯地平浓度依赖性降低细胞内钙离子浓度。相同浓度左旋氨氯地平降低细胞内钙离子浓度比混旋氨氯地平强，原因可能是由于混旋氨氯地平是由等量左旋和右旋氨氯地平混合而成。而加入不同浓度右旋氨氯地平后心室肌细胞内荧光信号强度和荧光信号比值无变化，心室肌细胞内钙离子浓度不改变，说明右旋氨氯地平对L型钙通道无阻滞作用。
参考文献
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(收稿日期:2007-06-14)(供稿编辑：邓宪文)
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